爱乐新对猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型(PRRSV2) 和欧洲型(PRRSV1)的抑制效果评价

吴伟鑫 周磊
（中国农业大学猪病研究室 2022年10月16日 ）

一、实验目的

1. 评估爱乐新对PRRSV的抑制效果。
2. 探究爱乐新对血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）（宿主抗PRRSV病毒因子）转录水平的影响。

二、实验内容

1. 确定爱乐新对MARC-145细胞及猪原代肺泡巨噬细胞（PAMs）的安全药物浓度。
2. 确定爱乐新对MARC-145细胞及PAMs中对PRRSV的半数抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC₅₀）。
3. 评估爱乐新对不同类型PRRSV毒株的抑制效果差异。
4. 评估爱乐新对靶细胞HO-1转录水平的影响。

三、实验材料

1. 细胞：MARC-145细胞购自中国科学院昆明细胞库，由本实验室保存，原代肺泡巨噬细胞由SPF仔猪灌肺取得；
2. 病毒：高致病性PRRSV毒株JXwn06、类NADC30毒株CHsx1401、NADC34重组毒株SDlz20-04、带有HiBiT标签的JXwn06荧光素酶重组病毒RvJX-Nsp2₃₂₅-HiBiT以及欧洲型毒株GZ11-G1均由中国农大构建或保存；
3. 细胞培养基：胎牛血清、1640培养基、DMEM培养基购自赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher, MA, USA）；
4. 抗病毒药物：含25%酒石酸泰万菌素的可溶性爱乐新药物由浙江伊科拜克动物保健品有限公司提供；
5. 主要分子生物学试剂：CCK-8 Cell Counting Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System试剂购自普洛麦格生物科技有限公司（Promega Corporation, Wisconsin, USA），MagZol^TM试剂购自广州美基生物科技有限公司，FastKing cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技有限公司，SYBR^TMSelect预混液购自赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher, MA, USA），三氯甲烷、异丙醇等化学试剂均购自北京化学试剂公司、PRRSV N蛋白特异性单克隆抗体由北京农大构建并保存；
6. 细胞培养箱、37℃温箱、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、-80 ℃超低温冰箱、BeyoGold^TM 全黑平底96孔细胞培养板、微量振荡器、涡旋振荡器、TECAN SPARK多功能微孔板酶标仪、光学显微镜、荧光显微镜及成像系统、超净工作台、生物安全柜等。

四、实验方法

1. 1.0 mg/mL爱乐新泰万菌素储备液的配制：

准确称取40 mg含25%酒石酸泰万菌素的可溶性爱乐新药物，加入9 mL无菌水，涡旋振荡使其溶解，定容至10 mL。经0.22 μm滤器过滤分装于1.5 mL离心管中，做好标记-20 ℃避光保存备用；

2. 爱乐新安全药物浓度的检测：

对PAMs组设立1 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL浓度的试验组，每组设3个生物学重复；对MARC-145细胞组设立20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL浓度的试验组，每组设3个生物学重复。

将PAMs及MARC-145细胞均匀铺于96孔细胞培养板各孔中，置于37 ℃细胞培养箱中分别培养至贴壁或100%单层，弃去培养液。以含2% FBS的培养基稀释各药物储备液，分别加入培养板中，mock组添加含2% FBS的培养基，置于细胞培养箱中继续培养36 h（PAMs）或48h（MARC-145细胞）后，按CCK-8 Cell Counting Kit使用说明书进行细胞毒性测试。

3. 爱乐新半数抑制浓度的检测：

对PAMs组设立5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL浓度的试验组，每组设3个生物学重复；对MARC-145细胞组设立25 μg/mL、30 μg/mL、35 μg/mL、40 μg/mL、45 μg/mL、50 μg/mL浓度的试验组，每组设3个生物学重复。

将PAMs及MARC-145细胞均匀铺于96孔细胞培养板中，置于37 ℃细胞培养箱分别培养至贴壁或100%单层，弃去培养液。以MOI = 0.1将RvJX-Nsp2325-HiBiT病毒接种至各孔，感作1 h。以含2% FBS的培养基稀释各药物储备液，分别加入培养板中，mock组添加含2% FBS的培养基，置于细胞培养箱中继续培养36 h（PAMs）或48h（MARC-145细胞）后，置于-80℃超低温冰箱。冻融两次后，置于微量振荡器上振荡混匀，各孔移取50 μL病毒裂解液于全黑平底96孔细胞培养板中，按Nano-Glo® HiBiT Lytic使用说明书进行相对荧光素酶活性检测。使用CurveExpert 1.4进行非线性回归分析，基于不同处理组的病毒抑制效率建立曲线，计算IC50。

4. 爱乐新对不同类型PRRSV毒株的抑制效果差异

将PAMs铺于48孔细胞培养板中，培养至贴壁后用含2% FBS的培养基稀释药物至接近最大安全浓度的20 μg/mL浓度预培养1h，将北美型HP-PRRSV毒株JXwn06、类NADC30毒株CHsx1401、NADC34重组毒株SDlz20-04以及欧洲型毒株GZ11-G1用20 μg/mL药物稀释至MOI = 0.1后接至各孔，感作1h后弃液，用含20 μg/mL药物的2% FBS培养基继续培养，对照组加入等量含2% FBS的培养基，培养36h后固定，使用PRRSV N蛋白特异性单抗进行间接免疫荧光试验（IFA），评估爱乐新对不同类型毒株的抑制效果。

5. 爱乐新对靶细胞HO-1转录水平的影响评估：

将PAMs均匀铺于24孔细胞培养板中，待细胞贴壁后弃去培养液，设立mock组及接毒组，二组均含接药处理及不接药处理。接毒组以MOI = 0.1接种RvJX-Nsp2325-HiBiT，对照组加入等量含2% FBS的培养基，感作1h后弃液，二组的含药处理均以接近最大安全浓度的20 μg/mL药物进行培养，不含药处理加入等量含2% FBS的培养基，培养12h后收样，按照MagZolTM试剂说明书提取RNA，按照FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明书进行反转录，按照SYBRTM Select试剂盒说明书进行荧光定量PCR扩增，引物见表1。每组做3个生物学重复，下游荧光定量PCR检测设2个技术重复，通过相对定量法分析HO-1转录水平的差异。
表1  本试验荧光定量PCR分析所用引物序列

五、实验结果

1. 爱乐新在MARC-145细胞中的最大安全浓度接近40 μg/mL；

图1  爱乐新对MARC-145细胞活性的影响

表2  爱乐新培养MARC-145细胞48h后的细胞活性（平均值±标准差，%）

2. 爱乐新在PAMs中的最大安全浓度接近20 μg/mL；

图2  泰万菌素对PAMs活性的影响

表3  泰万菌素培养PAMs 36h后的细胞活性（平均值±标准差，%）

3. 爱乐新对PRRSV的半数抑制浓度

接毒后使用含各浓度爱乐新的培养基继续培养MARC-145细胞48h后对病毒的抑制效率如图3所示，使用CurveExpert 1.4进行非线性回归分析，抑制效率曲线的最佳拟合模型均为“Logistic模型”，曲线对应IC₅₀为28.268 μg/mL；

图3  爱乐新培养MARC-145细胞48h对病毒的抑制效率

接毒后使用含各浓度爱乐新的培养基继续培养PAMs 36h后对病毒的抑制效率如图4所示，使用CurveExpert 1.4进行非线性回归分析，抑制效率曲线的最佳拟合模型均为“MMF模型”，对应IC₅₀为17.109 μg/mL；

图4  爱乐新培养PAMs 36h对病毒的抑制效率

总体看来，爱乐新在MARC-145细胞上的IC₅₀略大于PAMs，说明药物对PAMs PRRSV感染的抑制作用强于MARC-145细胞。在药物浓度达到MARC-145细胞最大安全浓度40 μg/mL时，对PRRSV的抑制率可以达到90.03±2.14%。药物在PAMs上的半数抑制浓度与最大安全浓度较为接近，在药物浓度达到PAMs最大安全浓度20μg/mL时，有80.87±1.64%的PRRSV被抑制。

4. 爱乐新对不同类型PRRSV毒株的抑制效果差异

使用20 μg/mL爱乐新在接毒前1h、感作中1h及接毒后36h持续作用于PAMs，以IFA检测药物对高致病性PRRSV毒株JXwn06、类NADC30毒株CHsx1401、NADC34重组毒株SDlz20-04以及欧洲型毒株GZ11-G1感染的作用，可见爱乐新对不同类型的毒株均有一定的抑制作用。

5. 爱乐新对PAMsHO-1转录水平的影响

使用含20 μg/mL药物的培养基或不含药物的培养基对接毒组及对照组的PAMs培养12h后，不接毒组爱乐新处理后细胞HO-1基因转录水平上调5.04±0.64倍，接毒组爱乐新处理后细胞HO-1基因转录水平上调7.34±0.31倍。结果表明，爱乐新能够刺激靶细胞HO-1基因转录水平的上调。

图6  安全浓度爱乐新处理对PAMs HO-1转录水平的影响

六、试验结论

1. 爱乐新在MARC-145细胞和PAMs中的安全药物浓度分别为40 μg/mL 和20 μg/mL。
2. 爱乐新在MARC-145细胞中的IC₅₀为268 μg/mL，在添加最大安全浓度40 μg/mL的爱乐新时对PRRSV的抑制率可以达到90.03±2.14%；爱乐新在靶细胞PAMs中的IC₅₀为17.109 μg/mL，在添加最大安全浓度20μg /mL的爱乐新时，有80.87±1.64%的PRRSV被抑制。
3. 爱乐新对HP-PRRSV、类NADC30毒株、类NADC34重组毒株以及欧洲型毒株GZ11-G1均具有抑制作用。
4. 爱乐新能够刺激宿主抗病毒相关因子HO-1转录水平的上调。